Sistemas de secreción de tipo VI y vesículas extracelulares de membrana bacterianas

Foto de grupo: De izquierda a derecha: Alejandro Arce, José Manuel Borrero, Andony Flores, Camilo Vásquez, Cristina Civantos, Patricia Bernal, Javier de la Peña, Adrián Ruiz y María Olmo

Nuestro grupo está constituido por dos investigadores principales y sus equipos con líneas convergentes de investigación: Patricia Bernal Guzmán, y Jose Manuel Borrero de Acuña.

Estudiamos los mecanismos moleculares de diferentes sistemas de secreción especialmente el Sistema de Secreción de tipo VI (T6SS) y las Vesículas Extracelulares de Membrana (VEM) bacterianas, las cuales han sido propuestas como el sistema de secreción de tipo 0 (T0SS).

En los últimos años, los dos grupos de investigación han aunado su conocimiento para llevar a cabo una nueva línea de investigación en el estudio de las vesículas de Pseudomonas. El interés de esta nueva línea reside en la caracterización de las mismas, los complejos multiproteicos implicados en su biogénesis, así como su bioingeniería para transportar agentes antimicrobianos en la lucha contra microorganismos patógenos. Está línea de investigación de ciencia básica tiene potenciales aplicaciones biotecnológicas en el campo de la agricultura y la ganadería sostenible, así como la biomedicina al estudiar mecanismos moleculares de control del crecimiento bacteriano.

A continuación, se detallan los componentes del grupo por orden alfabético:

o Arce Rodríguez, Alejandro – Investigador postdoctoral senior

o Ayala García, Paula – Investigadora postdoctoral

o Azogue Palma, Carlos – Becario contratado de proyecto

o Bernal Guzmán, Patricia – Contratada Ramón y Cajal

o Borrero de Acuña, José Manuel – Contratado Emergia

o Civantos Jiménez, Cristina – Técnico de laboratorio

o de la Peña Noya, Javier – Becario predoctoral contratado por proyecto

o Herrero Gómez, Irene – Becaria predoctoral FPU

o Moreno de Castro, Natalia – Becaria predoctoral FPU

o Paredes Bermejo, María del Carmen – Técnico de laboratorio

o Ruiz Camas, Adrián – Técnico de laboratorio

 

Proyectos conjuntos

• Título del Proyecto: Engineering extracellular membrane vesicles from rhizospheric bacteria for the development of biopesticides and plant-growth promoting agents.
  • Entidad Financiadora: Proyectos de Excelencia 2021. Secretaría General de Universidades, Investigación y Tecnología, Junta de Andalucía.
  • Referencia: ProyExcel_00450                                                 Entidad Líder: Universidad de Sevilla    Periodo: diciembre 2022-noviembre 2025
  • Cuantía de la subvención: 140.937,14€                                 Investigadores Responsables: Jose Manuel Borrero de Acuña & Dra Patricia Bernal

• Título del Proyecto: Desarrollo de pesticidas biológicos basados en vesículas de membrana como alternativa sostenible a los pesticidas químicos altamente contaminantes (BIOPESTOMV).
  • Entidad Financiadora: Ministerio de Ciencia e Innovación, Proyectos Estratégicos Orientados a la Transición Ecológica y a la Transición Digita 2021, Gobierno de España
  • Referencia: TED2021-130357B-I00                                       Entidad Líder: Universidad de Sevilla    Periodo: diciembre 2022-noviembre 2024
  • Cuantía de la subvención: 253.000,00€                                 Investigadores Responsables: Dra Patricia Bernal & Jose Manuel Borrero de Acuña

 

Estudiantes Predoctorales conjuntos

Javier de la Peña Noya – Caracterización y bioingeniería de las VEM de Pseudomonas putida KT2440.

 

Publicaciones conjuntas

• Borrero de Acuña, J. M., & Bernal, P.*; (2021). Plant holobiont interactions mediated by the type VI secretion system and the membrane vesicles: promising tools for a greener
  agriculture. Environmental Microbiology, 23(4), 1830-1836.

 

Dissecting the multiprotein complexes and molecular mechanisms sustaining bacterial membrane vesicles biogenesis: towards extracellular membrane vesicle cargo engineering   

IP: Jose Manuel Borrero de Acuña

Research in our lab:

One of our major endeavours is to elucidate protein complex assembly dynamics involved in crucial biological processes for diverse bacteria. The majority of cellular functions in all living cells are conducted by proteins. Biochemical pathways, signal transduction cascades, and membrane-associated complexes of energy generation rely on the fine-tuned, directed and frequently transient protein interactions. We have widely investigated biochemical processes for relevant human pathogens (Legionella pneumophila, Clostridioides difficile and Pseudomonas aeruginosa) and environmentally relevant bacteria (Dinoroseobacter shibae and P. putida); (see publications: https://orcid.org/my-orcid?orcid=0000-0002-6409-8110). Dissecting the protein-protein interactions underlying such processes is crucial for basic research but it is also a cornerstone for boundless biomedicine and biotechnological applications. We also investigate the molecular processes governing organisms’ interactions in their natural niche. Our interest is drawn towards the elucidation of the biogenesis pathways and cell-to-cee communication mechanisms driven by extracellular membrane vesicles (EMVs). EMVs are nanoparticles involved in a broad range of biological processes including horizontal DNA transfer, decoy for phages and antibiotics, disposal of waste material and surface remodeling, nutrient scavenging, bacterial killing, host response immunomodulation and delivery of bioactive compounds and thus are essential for inter- intra-species and inter-kingdom communication. Recently, interactomic-driven research has led us to the identification of highly conserved proteins sustaining EMV formation across species. In our current projects we propose to exploit the full potential of EMVs for the benefit of bacteria-plant interactions. To this end, we employ interactomics techniques consisting of affinity purification coupled with mass spectrometry, SPOT-membrane arrays, immunofluorescence and immunogold labelling microscopy and others to identify further protein-protein interactions underlying the biogenesis of EMVs in different bacterial species present in the plant holobiont. We induce the expression of these proteins found in the interactomic studies to modulate vesicle formation rate, size and amount. We intend to tailor the protein and metabolic cargo of EMVs by encapsulating nodulation factors, plant-priming molecules, nitrogen nitrogen-fixing enzymes or phytopathogen inhibitors. Thereby, EMVs can be used as organism-free biopesticides for phytopathogen killing or as bioinoculants to enhance nodulation, nitrogen fixation and ultimately plant growth. Nonetheless, EMV research go beyond the applications related to sustainable agriculture since novel molecular tools arising from this work can be applied in multiple disciplines, ranging from biomedicine (development of vaccines) to bioremediation (design of EMV-based xenobiotic degraders).

 

Disección de los complejos multiproteicos y los mecanismos moleculares que sustentan la biogénesis de vesículas de membrana bacterianas: hacia la ingeniería del cargo de vesículas de membrana extracelulares 

Líneas de investigación en nuestro laboratorio:

Nuestro grupo se centra ampliamente en dilucidar la dinámica de ensamblaje de complejos proteicos implicados en procesos biológicos cruciales para diversas bacterias. La mayoría de las funciones celulares en todas las células vivas son realizadas por proteínas. Las rutas bioquímicas, las cascadas de transducción de señales y los complejos de generación de energía asociados a membranas dependen de interacciones proteicas dirigidas y frecuentemente transitorias. Investigamos ampliamente los procesos bioquímicos de patógenos humanos relevantes (Legionella pneumophila, Clostridioides difficile y Pseudomonas aeruginosa) y bacterias importantes para el medio ambiente (Dinoroseobacter shibae y Pseudomonas putida); (ver publicaciones: https://orcid.org/my-orcid?orcid=0000-0002-6409-8110). Diseccionar las interacciones proteína-proteína que subyacen a tales procesos es crucial para la investigación básica, pero también es un pilar para múltiples aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. También investigamos los procesos moleculares que rigen las interacciones de los organismos en su nicho natural. Nuestro interés se centra en la dilucidación de las vías de biogénesis y los mecanismos de comunicación entre células impulsados por vesículas extracelulares de membrana (VEMs). Las VEMs son nanopartículas que intervienen en una amplia gama de procesos biológicos, como la transferencia horizontal de ADN, la función de señuelo para fagos y antibióticos, la eliminación de material de desecho y la remodelación de superficies, la eliminación de nutrientes, la eliminación de bacterias, la inmunomodulación de la respuesta del huésped y el suministro de compuestos bioactivos, por lo que son esenciales para la comunicación entre especies y entre reinos. Recientemente, nuestra investigación basada en  interactómica nos ha conducido a la identificación de proteínas altamente conservadas que sustentan la formación de VEMs entre especies. Actualmente, proponemos explotar todo el potencial de las VEMs en beneficio de las interacciones bacteria-planta. Para ello, empleamos técnicas de interactómica consistentes en purificación por cromatografía de afinidad acoplada a espectrometría de masas, matrices de membranas SPOT, microscopía de inmunofluorescencia e inmunomarcaje con partículas de oro, entre otras, para identificar otras interacciones proteína-proteína subyacentes a la biogénesis de las VEMs en diferentes especies bacterianas presentes en el holobionte. Seguidamente, inducimos la expresión de estas proteínas encontradas en los estudios interactómicos para modular la tasa, el tamaño y la cantidad de formación de vesículas. Pretendemos adaptar la carga proteínica y metabólica de las VEMs encapsulando factores de nodulación, moléculas para la «vacunación» de plantas, enzimas fijadoras de nitrógeno o inhibidores de fitopatógenos. De este modo, los VEMs pueden utilizarse como biopesticidas para eliminar fitopatógenos o como bioinoculantes para mejorar la nodulación, la fijación de nitrógeno y, en última instancia, el crecimiento de las plantas. No obstante, la investigación de las VEMs va más allá de las aplicaciones relacionadas con la agricultura sostenible, ya que las nuevas herramientas moleculares derivadas de este trabajo pueden aplicarse en múltiples disciplinas, que van desde la biomedicina (desarrollo de vacunas) a la biorremediación (diseño de degradadores de xenobióticos basados en VEMs).

The following techniques are available in our lab:

Figure 1. General interactomic workflow. The illustration depicts step by step the protein–protein interaction elucidation pathway via affinity chromatography copurification coupled with mass spectrometry (Borrero de Acuña, J. M. et al 2017).

 

Figure 2. Experimental workflow designed for the isolation and characterisation of extracellular membrane vesicles (EMVs). (1) Growth of bacterial culture under standard conditions to produce EMVs. (2) Harvesting of cells and filtering of supernatants to remove remaining cells. (3) Ultrafiltration to remove impurities and concentrate EMV fractions. (4) Ultracentrifugation to collect EMV fractions. (5) Evaluation of the EMVs structure and integrity by electron microscopy. (6) Quantification of EMVs using scattering-light reliant Nanosight technology. Abbreviations: EMVs = extracellular membrane vesicles.

Research projects

• Title: Enhancing the symbiotic cross-talk through rhizobial membrane vesicles.
  • Funding Entity: Ministerio de Ciencia e Innovación, Proyectos de Generación de Conocimiento 2021, Gobierno de España
  • Reference: PID2021-122395OA-I00                                      Affiliation: Universidad de Sevilla    Duration: septiembre 2022-agosto 2026
  • Funding Granted: 145.200,00€                                              Principal Investigator: Dr Jose Manuel Borrero de Acuña
• Title: Engineering membrane vesicles for fine-tuned modulation of rhizobia species interactions for enhanced nodulation and plant growth.
  • Funding Entity: Junta de Andalucía, Consejería de transformación económica, industria, conocimiento y universidades
  • Reference: EMERGIA20_00048                                             Affiliation: Universidad de Sevilla
  • Duration: noviembre 2021- agosto 2025                                 Principal Investigator: Dr Jose Manuel Borrero de Acuña
• Title: Developing a rodent disease model for Pseudomonas aeruginosa infection in bronchiectasis for drug research.
  • Funding Entity: Federal Ministry of Education and Research (Germany)
  • Reference: 281361126/GRK2223                                             Affiliation: Technical University Braunschweig
  • Duration: diciembre 2020- noviembre 2023                              Principal Investigator: Dr Jose Manuel Borrero de Acuña

Selected publications

• Jiménez-Guerrero, I., López-Baena, F. J., Borrero-de Acuña, J. M.* & Pérez-Montaño, F. (2023). Membrane vesicle engineering with «à la carte» bacterial-immunogenic molecules for
  organism-free plant vaccination. Microbial Biotechnology, (accepted; ahead of print). *Corresponding author
• Borrero‐de Acuña, J. M., & Poblete‐Castro, I.* (2023). Rational engineering of natural polyhydroxyalkanoates producing microorganisms for improved synthesis and
  recovery. Microbial Biotechnology, 16(2), 262-285.
• Michel, A. M., Borrero‐de Acuña, J. M.*, Molinari, G., … & Jahn, D. (15 authors); (2022).Cellular adaptation of Clostridioides difficile to high salinity encompasses a compatible solute‐
  responsive change in cell morphology. Environmental Microbiology, 24(3), 1499-1517.*Corresponding author
• Borrero‐de Acuña, J. M., Gutierrez‐Urrutia, I., Hidalgo‐Dumont, C., … & Poblete‐Castro, I.*; (14 authors); (2020). Channelling carbon flux through the meta‐cleavage route for improved
  poly (3‐hydroxyalkanoate) production from benzoate and lignin‐based aromatics in Pseudomonas putida H. Microbial Biotechnology 14(6), 2385-2402.
• Borrero-de Acuña, J. M., & Poblete-Castro, I.*; (2020). Expanding the Reach of Recombineering to Environmental Bacteria. Trends in Biotechnology, 38(7):684-685.
• Poblete-Castro, I., Aravena-Carrasco, C., Orellana-Saez, M., Pacheco, N., Cabrera, A., & Borrero-de Acuña, J. M.*; (2020). Engineering the osmotic state of Pseudomonas putida
  KT2440 for efficient cell disruption and downstream processing of poly (3-hydroxyalkanoates). Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 8: 161. *Corresponding author
• Borrero-de Acuña, J.M.*, Timmis, K.N., Jahn, M. & Jahn, D. (2017). Protein complex formation during denitrification by Pseudomonas aeruginosa. Microbial Biotechnology, 10(6),
  1523-1534. *Corresponding author
• Borrero-de Acuña, J.M.*, Hidalgo-Dumont, C., Pacheco, N., Cabrera, A. & Poblete-Castro, I.* (2017). A novel programmable lysozyme-based lysis system in Pseudomonas
  putida for biopolymer production. Scientific Reports, 29;7(1): 4373. *Co-Corresponding authors
• Borrero-de Acuña, J.M., Rohde, M., Wissing, J., … & Jahn, D.*; (9 authors). (2016) Protein network of the Pseudomonas aeruginosa denitrification apparatus. Journal of
  Bacteriology. 198(9): 1401-13

PhD students

• Irene Herrero Gómez: Enhancing the symbiotic cross-talk through rhizobial membrane vesicles.
• Natalia Moreno de Castro: Engineering membrane vesicles for fine-tuned modulation of rhizobia species interactions for enhanced nodulation and plant growth.
• Carlos Azogue Palma: Engineering membrane vesicles for efficient production of industrially valuable chemicals.

 

 

El sistema de secrecion de tipo VI (T6SS) de Pseudomonas putida 

IP: Patricia Bernal

La línea de investigación de la Dra. Bernal se centra en el estudio de los Sistemas de Secreción de Tipo VI (T6SS) en Pseudomonas putida. P. putida es una bacteria del suelo con la capacidad de colonizar la raíz de diferentes plantas de cultivo proporcionando ventajas de crecimiento y al mismo tiempo protección contra patógenos; por ello esta cepa es considerada un excelente agente de control biológico (biocontrol). El biocontrol de las enfermedades producidas por patógenos de plantas se considera una excelente alternativa a los pesticidas químicos para proteger nuestros cultivos, ya que estos pueden provocar la contaminación del subsuelo y la pérdida de la microbiota natural tanto del suelo como de la planta. Para progresar en este campo de investigación, es clave entender de una manera global y completa los mecanismos moleculares de control biológico llevados a cabo por agentes de biocontrol conocidos y bien establecidos como Pseudomonas putida.

En P. putida, el T6SS ha sido establecido recientemente como un importante mecanismo de control biológico  que confiere a esta estirpe casi la totalidad de su capacidad biocontroladora (Bernal et al. 2017). El T6SS se considera una potente arma antibacteriana y P. putida lo usa eficientemente para aniquilar patógenos de plantas extremadamente deletéreos como Pseudomonas syringae o Agrobacterium tumefaciens. P. putida contiene tres T6SSs denominados K1-, K2- y K3-T6SS. El K1-T6SS se induce en fase de crecimiento estacionaria, secreta toxinas y destruye a una amplia gama de bacterias fitopatógenas tales como P. syringae, Xanthomonas campestris o Agrobacterium tumefaciens (Bernal et al. 2017, Bernal et al. 2021). Esta capacidad antimicrobiana ante fitopatógenos se ha observado tanto en experimentos in vitro como en experimentos in planta (Bernal et al. 2017, Bernal et al. 2021).

A nivel estructural, el T6SS es una nanomáquina contráctil formada por un componente de membrana, una cola (tubo y vaina contráctil) y una placa base. El componente de membrana ancla el sistema a la envoltura celular que reúne a los componentes de la placa base desde donde polimeriza la cola. Una vez el sistema está ensamblado, la vaina se contrae y el tubo con las proteínas efectoras se eyecta al interior de las células dianas (Fig. 3). Un componente elemental de este sistema, la proteína TssA, es indispensable para el ensamblaje de la vaina. A pesar de su función clave, las proteínas TssA exhiben una diversidad inesperada y existen en dos formas principales, una forma corta (TssA_S) y una forma larga (TssA_L). Mientras las proteínas TssA_L interactúan con la proteína TagA para anclar el extremo distal de la vaina extendida, el mecanismo de estabilización de los T6SS que contienen TssA_S siguía siendo desconocido. En un estudio reciente (Bernal et al., 2021) hemos identificado una nueva categoría de componentes estructurales (proteínas TagB y TagJ) que interactúan con proteínas TssA_s y contribuyen al ensamblaje del T6SS estabilizando la vaina polimerizada desde la placa base. Además, hemos demostrado que la presencia de estos componentes es importante para la extensión completa de la vaina y para mantener una capacidad de disparo óptima. Asimismo, se ha visto que la asociación de las distintas formas de proteínas TssA con una clase diferente de proteínas estabilizadoras de la vaina resulta en T6SS que bien residen en la célula durante algún tiempo (TssA_L-TagA) o disparan inmediatamente después de la extensión de la vaina (TssA_S-TagB). Se propone, que esta diversidad en la dinámica de tiro podría contribuir a la especialización del T6SS para adaptarse a diferentes estilos de vida bacterianos en diversos nichos ambientales (Bernal et al., 2021).

Las líneas de investigación que se llevan a cabo en el laboratorio de la Dra. Bernal están dirigidas a conocer más fondo la función y el mecanismo de acción de estos sistemas antimicrobianos, lo que permite adaptarlos para desarrollar agentes de biocontrol altamente eficaces que sean más específicos y con una mayor potencia para erradicar patógenos de plantas y ser una herramienta para futuras aplicaciones biotecnológicas aplicadas a la agricultura.

En este video se resume el proyecto financiado por la Fundación BBVA entre 2021-2022 y titulado: El superagente de biocontrol Pseudomonas putida KT2440 como medida sostenible de lucha frente a Xylella fastidiosa, la gran amenaza de nuestro olivar.

 

Proyectos activos

• Título del Proyecto: The T6SS antibacterial arsenal of the biocontrol agent Pseudomonas putida. Discovering novel compounds to fight antimicrobial resistance (AMR) and enhance crop protection.
  • Entidad Financiadora: Ministerio de Ciencia e Innovación, Proyectos de Generación de Conocimiento 2021, Gobierno de España
  • Referencia: CNS2022-135585                                      Entidad Líder: Universidad de Sevilla    Periodo: septiembre 2023-agosto 2025
  • Cuantía de la subvención: 199.154,00€                                 Investigadora Responsable: Dra Patricia Bernal
• Título del Proyecto: Optimizando Pseudomonas putida como agente protector de cultivos: señales ambientales, especificidad y eficiencia del sistema de secreción tipo vi como arma de biocontrol
  • Entidad Financiadora: Ministerio de Ciencia e Innovación, Proyectos de Generación de Conocimiento 2021, Gobierno de España
  • Referencia: PID2021-123000OB-I00                                      Entidad Líder: Universidad de Sevilla    Periodo: septiembre 2022-agosto 2025
  • Cuantía de la subvención: 175.450,00€                                 Investigadora Responsable: Dra Patricia Bernal
• Título del Proyecto: Estudios de control biológico para la protección de cultivos a través del uso del sistema de secreción de tipo VI (T6SS) bacteriano
  • Entidad Financiadora: Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Programa Ramón y Cajal Convocatoria 2019, Gobierno de España
  • Referencia: RYC2019-026551-I                                               Entidad Líder: Universidad de Sevilla
  • Periodo: abril 2021-marzo 2026                                                Investigadora Responsable: Dra. Patricia Bernal

Publicaciones destacadas

• Allsopp LP* & Bernal, P* (2023).  Killing in the name of: T6SS structure and effectors diversity. Microbiology e1367. (*Co-autora de correspondencia).
• Bernal, P*, Civantos, C, Pacheco-Sánchez, D, Quesada, JM, Filloux, A*, and Llamas*, MA (2023).  Transcriptional organization and regulation of the Pseudomonas putida K1 Type VI secretion system gene cluster. Microbiology 169:001295. (*Co-autora de correspondencia).
• González-Magaña, A, Altuna,J, Queralt-Martín, M, Largo, E, Velázquez, C, Montánchez, I, Bernal, P, Alcaraz, A, Albesa-Jové, D (2022). The P. aeruginosa effector Tse5 forms ion-selective membrane pores that disrupt the membrane potential of intoxicated bacteria. Communications Biology. 5:1189.
• Durán, D, Bernal, P, David Vazquez-Arias, Blanco-Romero, E, Garrido-Sanz, D, Redondo-Nieto, M, Rivilla, R and, Martin, M. (2021). Pseudomonas fluorescens F113 type VI Secretion Systems mediate bacterial killing and adaption to the rhizosphere microbiome. Scientific Report  11:5772-5785.
• Bernal, P, Furniss, CD, Fecht, S, Leung, RCY, Spiga, L, Mavridou, DAI & Filloux. (2021). A novel stabilization mechanism for the type VI secretion system sheath. Proc Natl Acad Sci.  118:e2008500118
• Allsopp, LP, Bernal, P, Nolan, L & Filloux A. (2020). Causalities of War: The connection between T6SS & microbiota. Cell Microbiol 22:e13153.
• Bernal, P. *, Llamas, MA, Filloux, A. (2018). Type VI secretion Systems in plant-associated bacteria. Environ Microbiol 20:1-15 (*Autora de correspondencia).
• Bernal, P. *, Allsopp, L.P., Filloux, A., and Llamas M.A. (2017). The Pseudomonas putida T6SS is a plant warden against phytopathogens. ISME Journal 11:972-987  (*Autora de correspondencia).